У експериментах з ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) упаковка може здатися простим, але це безпосередньо впливає на стабільність реагенту, простоту використання та надійні результати. Незалежно від того, що зберігання та транспортування лабораторії - підготовлені реагенти чи комерційні премії, оволодіння належними методами упаковки ПЛР, може уникнути загальних помилок та підвищити експериментальну ефективність. Нижче ми ділимося практичними порадами щодо вибору матеріалів, стратегій упаковки та деталей зберігання.
I. Вибір пакувальних матеріалів: пріоритетність сумісності та захисності
Реакції ПЛР чутливі до температури, світла та забруднень, тому пакувальні матеріали повинні відповідати трьом ключовим вимогам: герметичністю, світлом - доказування та хімічної інертності.
Для центрифугних труб та ПЛР -плит є кращим поліпропіленом (PP), завдяки його високій прозорості та DNASE/RNASE - Вільні властивості . 0.2 мл тонких - трубки для стіни ідеально підходять для швидкого передачі тепла, тоді як 0,5 мл труб - це краще, щоб зафіксувати концентровані реагування. Для 96 - ПЛР-пластини рекомендуємо вибрати спідну конструкцію (для зручності роботизованих маніпуляцій) або нескінченного дизайну (для збереження простору).
Метод герметизації: Звичайні трубки для центрифуги використовують плоскі або підняті ковпачки (для запобігання випаровування та висихання). Однак для тривалого зберігання терміну -, тепло - ущільнювальна плівка (наприклад, парафільм) або дихаюча плівка (наприклад, Aeraseal) рекомендується збалансувати внутрішній та зовнішній тиск. ПЛР -пластини рекомендуються використовувати ущільнювачі алюмінієвої фольги (високий - стійкий до температури) або all {- адгезійна плівка (для одиночної - використання).
Захист світла: реагенти, що містять світло - чутливі інгредієнти (наприклад, певні барвники або праймери), повинні бути загорнені в алюмінієву фольгу, або чорні пластини ПЛР (доступні у деяких виробників).
Ii. Методи аликвотування: мінімізація втрат від повторного заморожування - цикли відтавання
Альхотінг -реагенти - це основний крок у упаковці ПЛР і безпосередньо впливає на експериментальну відтворюваність.
Основна суміш аликвотації: комерційні головні суміші (такі як фермент Taq та суміш DNTP) рекомендуються аликвотувати на основі об'єму реакції плюс 5% - 10% поля (наприклад, для реакції 20 мкл, аликвота 22 мкл на трубку). Уникайте використання безпосередньо з об'ємної упаковки, оскільки повторювані заморожування - цикли відтавання можуть призвести до зниження активності ферментів (фермент TAQ може втратити приблизно 5% активності на цикл замерзання-відтавання).
Праймери та шаблони: праймери (особливо спеціальні праймери) рекомендуються аликвотувати із 100 мкм розчинів запасів і зберігаються на - 20 градусів. Розведіть до робочої концентрації (як правило, 0,1–1 мкм) перед використанням. Такі шаблони, як геномна ДНК, повинні бути аликворовані в одиночній -, використовуйте величини, щоб уникнути перехресного забруднення.
Поради щодо запобігання забрудненню: Переконайтесь, що трубки для центрифуги сухих перед аликвотом (залишковий етанол може інгібувати ПЛР), до - прохолодних піпеткових кінчиків, щоб запобігти прилипленню холодних реагентів до стіни та носити рукавички протягом усього процесу, щоб уникнути забруднення ДНК шкіри.
Iii. Маркування та ведення реєстрації: Уникайте пастки "Чорна коробка"
Чітке маркування має вирішальне значення для упаковки ПЛР; Неправильне маркування може зіпсувати весь експеримент.
Обов’язкова інформація про маркування: Назва реагенту (наприклад, "2 × Taq MasterMix"), концентрація/вміст (наприклад, "10 мм dntps"), номер партії (для відстеження), умови зберігання (наприклад, "-20 градусів, захищені від світла"), дата аліккату та дата дії (наприклад, "використання протягом 6 місяців").
Спеціальне маркування: Якщо реагент містить гліцерин (антифриз), барвники (наприклад, Sybr Green) або добавки (наприклад, BSA), необхідно надати додаткову інформацію (наприклад, "містить 50% гліцерину, не зберігайте при високих температурах").
Синхронізація запису: Рекомендується використовувати програмне забезпечення електронної таблиці або лабораторного управління (наприклад, Labguru) для запису детальних параметрів вмісту кожної трубки (наприклад, послідовність праймерів, значення TM) та пов'язуйте їх із номером фізичної мітки.
Iv. Зберігання та транспортування: Температура балансування та фізичний захист
Стабільність реагентів ПЛР сильно залежить від умов зберігання, а під час транспортування необхідний додатковий захист.
Загальне сховище:
Ферменти (taq, зворотна транскриптаза): довгий - зберігання термінів на - 20 градусів (уникайте повторних циклів заморожування -відтавання; аликвота і зберігайте на -80 градусів для подальшого використання);
Праймери/зонди: зберігайте на -20 градусів протягом 1 року (якщо містить модифіковану групу, таку як біотин, захист від світла);
Не - буфери ферментів (наприклад, PBS): короткий - зберігання терміну на 4 градусах (до 1 місяця).
Вимоги до транспорту:
Для транспортування холодного ланцюга використовуйте сухий лід (- 78 градусів) для ферментів (підтримується нижче -20 градусів), а синій лід (близько 0 градусів) для буферів для короткочасного транспортування.
Уникайте надмірної вібрації (ПЛР -пластини повинні бути закріплені в пінопласті, щоб запобігти змішуванню реагентів між свердловинами).
Під час високих літніх температур додайте упаковку ізоляційного шару (наприклад, ізоляційна сумка з алюмінієвою фольгою + заморожений гель -пакет).
V. Загальні проблеми та рішення
Задача 1: Опад реагенту (наприклад, DNTP або MGCL₂ опадів при низьких температурах) → Розчин: коротко центрифуга (1000 об / хв, 1 хвилина) перед аликвотом. Розчиняйте в інкубаторі 37 градусів перед використанням та вихором, щоб ретельно змішати.
Задача 2: пластини ущільнювач легко відшаровується → Рішення: Виберіть тепло - стійкий ущільнювач з клейкою підкладкою або використовуйте герметик тепла (підходить для експериментів з пропускною здатністю -).
Проблема 3: Розмиті мітки → Рішення: Використовуйте водонепроникний маркер (наприклад, Sharpie) або лазер - Друкувати етикетки, щоб запобігти втіленню почерку.
Висновок
Упаковка ПЛР - це більше, ніж просто "упаковка" реагенти; Це перша лінія оборони для експериментальної надійності. Вибираючи відповідні матеріали, стандартизуючи процес аликвотації, підтримуючи ретельне маркування та підтримуючи суворе контроль температури під час транспортування, ви можете значно зменшити помилки людини, забезпечуючи більш стабільні реакції на ампліфікацію та більш надійні результати. Пам'ятайте: Деталі визначають успіх. Правильна практика упаковки ПЛР може заощадити значне усунення несправностей у всьому вашому експерименті!